HIF-1α/HIF-2α在恶性上皮性卵巢肿瘤中的表达及其对耐药机制影响的初步研究

【摘要】卵巢癌是严重威胁妇女健康的常见恶性肿瘤之一。在我国,卵巢癌的发病率在妇科恶性肿瘤中处第三位,死亡率居第一位。卵巢癌细胞原发性或继发性对多种化疗药物耐药是治疗失败的重要原因。越来越多的研究发现,肿瘤微环境与肿瘤的形成、发展以及肿瘤对治疗的抵抗密切相关。缺氧作为恶性肿瘤微环境的基本特征之一,广泛存在于各种实体肿瘤中。现有的研究证实,缺氧可以通过多种途径诱导肿瘤耐药,而作为细胞缺氧感受分子的缺氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor,HIF)在缺氧调控中处于中心地位,介导了大部分缺氧应激反应,使肿瘤细胞在适应恶劣环境的同时表现出对药物的抵抗,成为逆转肿瘤耐药的治疗靶点。HIF-1和HIF-2是HIF家族中的主要成员,都由不同功能亚基HIF-a和共有的HIF-β亚基共同组成。但已有的研究显示两者在分布存在差异；进一步研究表明,两者有不同的功能。这些提示两者在缺氧应激反应调控中可能存在独立性和协同性。尽管有关两者在结构、分布以及功能的比较性研究已经在不同肿瘤中开展。但在卵巢癌中,HIF-1和HIF-2的分布是否存在差异,仍缺乏大样本研究数据证实。如果存在差异,是什么原因导致尚不得而知。这种差异对卵巢癌细胞耐药性形成产生何种影响,尚不清楚。本研究从缺氧这一肿瘤特有的微环境出发,通过检测上皮性卵巢肿瘤中HIF-1α、HIF-2α和多药耐药基因1(MultidrugResistance1MDR1)产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,了解HIF-1α和HIF-2α与肿瘤耐药的关系。同时,利用CoCl2营造体外缺氧环境,建立卵巢癌SKOV-3细胞缺氧耐药细胞模型。通过检测缺氧过程中,HIF-1α、HIF-2α和P-gp的表达变化,探讨在慢性缺氧微环境中,HF-1α和HIF-2α、在上皮性卵巢癌耐药性形成中的作用。第一部分HIF-1α、HIF-2α和P-gp在上皮性卵巢肿瘤中的表达目的：明确HIF-1α、HIF-2α和P-gp在上皮性卵巢肿瘤中的表达,初步分析HIF-1α、HIF-2α和P-gp与上皮性卵巢肿瘤临床病理的联系以及三者间的相互关系。方法：按照严格的准入标准,搜集2005年1月-2008年12月在湘雅二医院手术,术后确诊为原发性上皮性卵巢肿瘤的病例,一共175例。通过免疫组织化学法检测HIF-1α、HIF-2α和P-gp在上皮性卵巢肿瘤中的表达。结果：①在良性、交界性、恶性上皮性卵巢肿瘤中,HIF-1α的阳性率分别为46.15%、61.90%、78.72%,差异有统计学意义(P<0.05),其表达强度的差异无统计学意义(P>0.05)。HIF-2α的阳性率分别为7.69%、47.62%、58.16%,差异有统计学意义(p<0.05),其表达强度的差异具有统计学意义(p<0.05)。P-gp的阳性率分别为30.77%、38.10%、60.28%,差异有统计学意义(P<0.05),其表达强度的差异无统计学意义(P>0.05)。②在浆液性、粘液性和内膜样恶性上皮性卵巢肿瘤中,HIF-1βHIF-2α和P-gp的阳性率均无统计学差异(P>0.05)。在高、中、低分化的恶性上皮性卵巢肿瘤中,HIF-1α、HIF-2α和P-gp的阳性率均无统计学差异(P>0.05)。在Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期恶性上皮性卵巢肿瘤中,HIF-1α和P-gp的阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05)；在Ⅲ-Ⅳ期恶性上皮性卵巢肿瘤中,HIF-2a的阳性率为73.24%,高于其在Ⅰ-Ⅱ期恶性上皮性卵巢肿瘤中的阳性率(41.79%),差异有统计学意义(P<0.05)。③在具有相同缺氧水平的组织中,HIF-1α和HIF-2α的阳性率分别为78.72%和58.16%,差异有显著统计学意义(P<0.01)。在坏死区周边组织中,HIF-2α的核阳性率(43.48%)高于HIFF-1α(31.31%),差异有统计学意义(P<0.05)。④恶性上皮性卵巢肿瘤中,HIF-1α与P-gp的表达呈正相关,相关系数r=0.604(P<0.01)；HIF-2α与P-gp的表达呈正相关,相关系数r=0.575(P<0.01)。结论：①在上皮性卵巢肿瘤中,HIF-1α和HIF-2α阳性率增加提示肿瘤恶性程度增高,HIF-2α的表达强度越强提示肿瘤恶性程度越局；HIF-1α高表达提示恶性上皮性卵巢肿瘤进展；③在同一缺氧水平下,HIF=1α阳性率高于HIF-2α,两者的阳性率存在差异,提示缺氧对HIF-1α和HIF-2α的表达存在不同影响；④恶性上皮性卵巢肿瘤中HIF-1α和HIF-2α均与P-gp的表达呈正相关。第二部分卵巢癌细胞SKOV-3体外缺氧模型构建及缺氧对顺铂疗效的影响目的：利用CoCl2模拟肿瘤缺氧,建立卵巢癌上皮细胞SKOV-3体外缺氧模型并检测缺氧状态下顺铂对其抑制率的影响。方法：用含0、25、50、100、150、200、250umol/LCoCl2的DMEM培养液培养卵巢癌细胞SKOV-3。用MTT法检测不同浓度COCl2对卵巢癌细胞SKOV-3的抑制情况；WesternBlot方法分别检测缺氧和常氧条件下卵巢癌细胞SKOV-3中HIF-1α和HIF-2α蛋白表达情况。MTT法分别检测缺氧组和常氧组中顺铂对卵巢癌细胞SKOV-3的抑制率。结果：①随CoCl2浓度增加,缺氧对卵巢癌细胞SKOV-3抑制率升高。②与常氧组相比,缺氧处理后HIF-1α和HIF-2α蛋白表达明显增加,其差异具有统计学意义(p<0.05)。③顺铂对卵巢癌细胞SKOV-3的抑制率在常氧组为83.7%,在缺氧组为53.5%,差异有统计学意义(p<0.05)；结论：①采用CoCl2建立了卵巢癌细胞SKOV-3体外缺氧模型；②缺氧诱导卵巢癌细胞SKOV-3对顺铂耐药。第三部分缺氧对HIF-la和HIF-2a表达的影响及其与卵巢癌耐药性形成的相关性研究目的：检测不同浓度CoCl2处理后,卵巢癌细胞SKOV-3中HIF-1α和HIF-2α的表达以及在不同缺氧时间作用下HIF-1α、HIF-2α和P-gp的表达,探讨慢性缺氧对HIF-1α和HIF-2α表达的影响以及HIF-1α和HIF-2α与P-gp在卵巢癌耐药性形成中的作用。方法：用含0.25.50.100.150.200.250umol/LCoCl2的DMEM培养液培养卵巢癌SKOV-3细胞,8h后提取mRNA和总蛋白。在缺氧模型中培养卵巢癌SKOV-3细胞0、2、4、8、12、24、48h后,分别提取mRNA和总蛋白。通过RT-PCR和WesternBlot检测卵巢癌细胞SKOV-3中HIF-1α、HIF-2α以及P-gpmRNA和蛋白表达情况。结果：①随CoCl2浓度增高,HIF-1α和HIF-2αmRNA及蛋白表达均增高；②缺氧<8h,HIF-1α、HIF-2α和P-gpmRNA及蛋白表达增高；缺氧≥8h,HIF-2α和P-gpmRNA和蛋白稳定表达,而HIF-1αmRNA和蛋白表达降低。结论：①不同浓度CoCl2诱导的缺氧影响HIF-1α和HIF-2α的表达；②持续性缺氧状态下细胞中HIF-1α和HIF-2α的表达存在时相差异,HIF-2α的表达比HIF-1α更稳定；③缺氧<8h,P-gp表达上调与HIF-1α和HIF-2α均有关；缺氧≥8h,P-gp的高表达与HIF-2α有关。
【作者】何凌；
【导师】朱付凡；刘毅智；
【作者基本信息】中南大学，妇产科学，2011，博士
【关键词】HIF-1α；HIF-2α；P-gp；上皮性卵巢肿瘤；CoCl2；卵巢癌SKCV-3细胞；体外缺氧模型；耐药；缺氧；

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